一、背景与意义

多光子荧光显微成像以近红外光源为激发，具备较强的穿透深度、优良的时空分辨率、较高信噪比和低侵入性等优势，因而在活体深层组织的成像中得到广泛应用。相较于传统单光子荧光成像，近红外光的引入显著提升了穿透能力。近红外二区的光源在生物组织中的散射更小、衰减更慢，进一步扩大了成像深度。

二、基本原理与系统

2.1 多光子荧光原理

染料分子在极短时间内吸收两光子或更多光子能量后被激发，经过非辐射过程回到基态并释放荧光能量。这一高阶非线性过程使荧光仅在聚焦点附近产生，从而实现三维层析成像。通常采用超短飞秒脉冲激光器作为光源，以获得高峰值功率，提升多光子吸收效率。荧光强度与激发光强度呈二次或三次方关系，从而在激光聚焦处产生信号，抑制了非聚焦区域的背景噪声。

2.2 系统构成要点

多光子显微镜的核心包括激发源、扫描模块、高数值孔径物镜与探测器。扫描模块在XY平面逐点扫描，得到二维像素点阵；在Z方向叠加不同厚度层，重建样品三维结构。常用的双光子物镜具有高数值孔径、适中的工作距离和良好的近红外透过性，以提高激发效率。探测端通常采用灵敏度高、响应快速的光电倍增管，用于单像素级信号采集VSport。

2.3 近红外光源及组织窗口

生物组织对不同波长的吸收与散射存在显著差异，近红外区域的传播损耗较低，形成所谓的组织光学窗口。NIR-I（700–950 nm）与NIR-II（1000–1700 nm）可分段提高穿透深度，其中NIR-II具有更低散射和更长的有效衰减长度。1300 nm与1700 nm附近是最优激发波段，广泛用于深部成像。常见激光方案包括：钛蓝宝石飞秒激光器，能覆盖690–1040 nm并可经光参量振荡器/放大器扩展至NIR-II波段；固定波长的掺铒/掺镱光纤激光器可在1000 nm与1500 nm获得自相位调制等效应，扩展到1300 nm与1700 nm窗口。激发光源的选择需兼顾染料/探针的光谱特性与组织穿透性。

三、应用研究

3.1 深部脑血管与神经成像

利用荧光蛋白、有机或无机荧光探针标记血管，结合1300 nm与1700 nm激发实现高分辨的双光子与三光子成像，成像深度可达数毫米，能够揭示小动物大脑血管网络的细节结构与血流动态。借助钙指示剂等功能探针，还可对深脑区的神经元形态及活性进行实时监测。近期研究显示，单一近红外二区激发亦可实现多色的三光子成像，覆盖血管与神经网络的同时观测。

3.2 经颅脑成像

要实现经颅成像需降低颅骨对光的衰减。借助NIR-II光源的低散射特性，在不破坏颅骨的前提下实现对皮层及其下层结构的高信噪比成像。通过高性能荧光探针，能够在完整颅骨条件下完成皮层血管网络的快速双光子成像，达到较高的时空分辨率。

3.3 肿瘤与心血管疾病的多光子成像

多光子成像可在活体内对肿瘤微环境进行高分辨成像，肿瘤血管在形态与分布上较正常组织呈现显著差异，便于术后残留病灶的识别。此外，借助特异性标记脂质的探针，已实现活体水平的动脉粥样硬化与脂肪肝等疾病的成像与评估。

四、展望

近红外光源与非线性激发相结合，是多光子荧光成像的核心优势。随着探针性能的提升和高功率飞秒激光技术的发展，双光子与三光子成像在脑科学及重大疾病研究中的应用将持续扩展，未来有望在更深层次、更高分辨率与更高信噪比的成像中实现突破性进展，推动生物医学研究和相关应用的深入发展。